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高效液相色谱法方法

发布者: admin 来源: 未知

一、引言
以液体为流动相的色谱体系称为液相色谱。柱色谱、薄层色谱、纸色谱等都属于此类色谱。最早的液相色谱(经典液相色谱)是1906年俄国植物学家Tswett在分离植物色素时建立的一种分离方法。它的原理是借助于样品中各组分分子在流动相(淋洗液)和固定相(色谱柱)之间作用力的差别而进行分离。
高效液相色谱法(high performance liquid chromatography, HPLC)是在经典液相色谱法的基础上,随着现代科学技术的发展而发展起来的一种高效、高速、高灵敏度的现代化分离方法。由于固定相和流动相的多样性,分离机理也是多种多样的,从原理上讲,只要是能溶解在流动相中的物质都可以用高效液相色谱来分离和分析。
高效液相色谱与气相色谱的主要区别在于高效液相色谱中的分离作用,是依据样品分子与固定相和流动相三者之间的作用力差别,而气相色谱是依据样品分子与固定相之间作用力的差别(流动相几乎不参与分离作用),高效液相色谱分析的是液体样品,可以在室温下进行分离,而气相色谱分析的是气体样品或是在高温下可以气化的样品,因此高效液相色谱法的应用范围非常广泛。在目前已知的有机化合物中,大约有80%的有机化合物可以用高效液相色谱法分析。
半经验性的塔板理论和范第姆特的速率理论以及用于气相色谱中的一些定性定量方法仍然适用于高效液相色谱。联用技术在高效液相色谱定性方面起着重要的作用,目前应用较普遍的是高效液相色谱一质谱(HPLC-MS),其他还有高效液相色谱-激光拉曼光谱、高效液相色谱-原子吸收光谱等。
二、方法原理
1、吸附色谱
吸附色谱(adsorption chromatography)也称液-固色谱,其固定相是固体吸附剂,常用的有硅胶、氧化铝、活性炭等无机吸附剂。硅胶是一种多孔性物质,因-O-Si(-O-)-O-Si(-O-)-O-结合而具有三维结构,表面具有硅羟基(≡Si-OH),此硅羟基呈微酸性,易与氢结合,是吸附的活性点。在吸附色谱中,样品主要靠氢键结合力吸附到硅羟基上,和流动相分子竞争吸附点,反复地被吸附,又反复地被流动相分子顶替解吸,随着流动相的流动而在柱中向前移动。因为不同的待测分子在固定相表面的吸附能力不同,因而吸附一解吸的速度不同,各组分被洗出的时间(保留时间)也就不同,使得各组分彼此分离。吸附色谱在早期的HPLC中应用得较多,现在被更方便和更有效的化学键合相反相分配色谱所代替。由于硅羟基活性点在硅胶表面常按一定几何规律排列,因此吸附色谱用于异构体的分离和族分离仍是最有效的方法。
2、分配色谱
分配色谱(partion chromatography)原本是基于样品分子在包覆于惰性载体(基质)上的固定相液体和流动相液体之间的分配平衡的色谱方法,因此也称液一液色谱。因为作固定相的液体往往容易溶解到流动相中去,所以重现性很差。如果将固定相通过化学键合的方法键合到惰性载体上,固定相就不会流失到流动相中去。基于这种思想发展起来的固定相就是当今在HPLC中应用最广泛的化学键合型固定相。如ODS(octa decyltrichloro silane,十八烷基三氯硅烷)固定相就是最典型的代表,它是将十八烷基三氯硅烷通过化学反应与硅胶表面的硅羟基结合,在硅胶表面形成化学键合态的十八碳烷基,其极性很小,而常用的流动相,如甲醇、乙腈以及它们与水的混合溶液,极性比固定相大,被称作反相HPLC。相反,如流动相的极性比固定相小,被称作正相HPLC。
3、离子交换色谱
离子交换色谱是根据不同样品离子与固定相(离子交换树脂)离子基团亲和力的差异而进行分离的一种色谱方法。固定相可用阳离子交换剂和阴离子交换剂或键合相的离子交换剂。流动相多采用盐类的缓冲溶液,通过改变流动相的pH值、离子强度,或加入有机溶液、配位剂等改变固定相的选择性,以获得样品的良好分离。
4、凝胶色谱
凝胶色谱是根据样品分子的尺寸不同而达到分离,因而凝胶色谱又常被称作体积排阻或空间排阻色谱。
凝胶色谱是以多孔性填料作固定相。样品分子的分离受填料孔径的影响,比填料孔径大的样品分子不能进入填料的孔内,最先流出色谱柱;填料颗粒上有很多不同尺寸的孔,在那些可以进入填料孔内的样品分子中,体积较大的样品分子可以利用的孔少,所以样品分子按体积从大到小的顺序依次流出色谱柱。在凝胶色谱中,流动相的作用不是为了参与分离,而是为了溶解样品或减小流动相黏度。以有机溶剂作流动相的称为凝胶渗透色谱(gel permeation chromategraphy,GPC),以水溶液作流动相的称为凝胶过滤色谱。
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